Зачем нужны is последовательности

– консервативный— покидая один участок, IS–элемент встраивается в другой;

– репликативный— синтезируется копия, которая встраивается в другой участок генома.

– координирующая взаимодействие внехромосомных факторов наследственности (плазмид, умеренных фагов, транспозонов) между собой и с бактериальной хромосомой для обеспечения их рекомбинации;

– регуляторная — участвуют в регуляции активности (инактивации или активации) генов бактериальной клетки, в которых произошла вставка IS–элемента;

– индукция мутаций при включении IS–элементов в бактериальную хромосому;

– являются генетическими маркерами вида (рода) бактерий.

Транспозоны

Транспозоны (Tn–элементы) — более сложно организованные транспозирующиеся и самоинтегрирующиеся фрагменты ДНК длиной 2 до 25 тысяч пар нуклеотидов. Способны менять место своей локализации в молекуле ДНК, а также мигрировать из одной молекулы ДНК в другую. Транспозоны распространяются среди различных видов бактерий, встраиваясь и перемещаясь среди хромосом, плазмид, умеренных фагов.

Транспозоны имеют особые концевые структуры нескольких типов, позволяющие отличать их от других фрагментов ДНК. Это позволило обнаружить транспозоны не только у бактерий и дрожжей, но и в клетках растений, насекомых, позвоночных живот­ных и человека. При интеграции транспозонов в хромосому клеток животных или человека они приобретают сходство с провирусами.

Состояние транспозонов в бактериальной клетке:

– интегрированное в репликон (реплицируется вместе с ним); при включении в бактериальную ДНК транспозоны вызывают в ней дуплика­ции, а при перемещении — делеции и инверсии,

– свободное автономное (замыкается в кольцо и не реплицируется).

Таким образом, транспозоны, как IS–последовательности, не способны к самостоятельной репликации и размножаются только в составе бактериальной хромосомы.

– консервативный — покидая один участок, IS–элемент встраивается в другой;

– репликативный — синтезируется копия, которая встраивается в другой участок генома.

– координирующая взаимодействие внехромосомных факторов наследственности (плазмид, умеренных фагов, транспозонов) между собой и с бактериальной хромосомой для обеспечения их рекомбинации;

– регуляторная — участвуют в регуляции активности (инактивации или активации) генов бактериальной клетки, в которых произошла вставка IS–элемента;

– индукция мутаций при включении IS–элементов в бактериальную хромосому;

Зачем нужны is последовательности

Мигрирующие генетические элементы бактерий. Транспозоны. Бактериофаги, как мигрирующие генетические элементы.

Мигрирующие генетические элементы — отдельные участки ДНК, способные осуществлять собственный перенос (транспозицию) внутри генома. Транспозиция связана со способностью мигрирующих элементов кодировать специфический фермент рекомбинации — транспозазу.

Вставочные (инсерционные) последовательности [IS-элементы (англ. insertion, вставка, + sequence, последовательность)] — простейший тип мигрирующих элементов (рис. 4-15, А); их величина не превышает 1500 пар оснований (в среднем 800-1400). IS-элементы самостоятельно не реплицируются и не кодируют распознаваемых фенотипических признаков. Содержащиеся в них гены обеспечивают только их перемещение из одного участка в другой.

Основные функции IS-последовательностей — регуляция активности генов бактериальной клетки (могут инактивировать гены, в которые включились, или, встраиваясь в хромосому, проявлять эффект промотора, включающего либо выключающего транскрипцию соответствующих генов), индукция мутаций типа делеций или инверсий (при перемещении) и дупликаций (при встраивании в хромосому), координация взаимодействий плазмид, траспозонов и профа-гов (как между собой, так и бактериальной хромосомой).

Рис. 4-15. Инсерционная последовательность (А), транспозон (Б).

Транспозоны (Tn-элементы) состоят из 2000-25 000 пар нуклеотидов, содержат фрагмент ДНК, несущий специфические гены, и два концевых IS-элемента (рис. 4-15, Б). При включении в ДНК бактерий транспозоны вызывают дупликации, при выходе из определённого участка ДНК— делеций, при выходе и включении обратно с поворотом фрагмента на 180 градусов— инверсии. Транспозоны не способны к самостоятельной репликации и размножаются только в составе бактериальной хромосомы.

Каждый транспозон обычно содержит гены, привносящие важные для бактерии характеристики типа множественной устойчивости к антибактериальным агентам. Поскольку транспозоны содержат гены, определяющие фенотипически выраженные признаки (например, устойчивость к антибиотикам), то их легче обнаружить, чем IS-элементы. В общем, для транспозонов характерны те же гены, что и для плазмид (гены устойчивости к антибиотикам, токсинообразования, дополнительных ферментов метаболизма).

Умеренные и дефектные бактериофаги также могут быть факторами изменчивости, напоминая по своим свойствам интегрированные плазмиды. Встраиваясь в бактериальную хромосому в форме профага (провируса), они вызывают лизогенизацию бактерий, которые могут приобретать новые свойства.

Бактериофаги, как мигрирующие генетические элементы. В некоторых ситуациях факторами изменчивости могут быть умеренные, или дефектные, фаги, поскольку они могут встраиваться в хромосому (состояние профага) и выходить из неё, захватывая иногда и гены хромосомы клетки-хозяина (см. раздел «Трансдукция»). Например, u-бактериофаг сходен с IS-элементами и транспозонами, так как способен включаться практически в любой участок бактериальной хромосомы, привнося свой генетический материал и вызывая мутагенный эффект. Сохраняя все типичные свойства фага, р-бактериофаг можно рассматривать как гигантский транспозон.

IS-элементы и транспозоны бактерий

IS-элементы (от англ, insertion sequences — последовательности- вставки) — это сегменты ДНК, способные как целое перемещаться из одного участка локализации в другой (рис. 5.6). IS-элементы содержат лишь те гены, которые необходимы для их собственного перемещения — транспозиции. Кроме того, IS-элементы имеют особую последовательность на концах, как правило, инвертированные повторы. При встраивании в новую последовательность ДНК IS-элементы вызывают небольшую дупликацию: дуплицированный участок с двух сторон фланкирует встроившийся IS-элемент. Характеристика типичных IS-элементов Е. coli представлена в табл. 5.4.

Типичные IS-элементы Е. coli

Суммарная длина, н. п.

Длина концевых инвертированных повторов, н. п.

Длина дуплицированной мишени, н. п.

Обычное местонахождение

Хромосома Е. coli, 19 копий; плазмида R6, две копии; Shigella dysenteria, > 40 копий

Хромосома Е. coli,

0—12 копий; R6, одна копия; F-плазмида, одна копия

Хромосома Е. coli, 1—2 копии

Транспозонами (Tn-элементами) называют сегменты ДНК, обладающие теми же свойствами, что и IS-элементы, но содержащие также гены, не имеющие непосредственного отношения к транспозиции (гены устойчивости к антибиотикам, гены токсинов или гены дополнительных ферментов клеточного метаболизма). В общем, для транспозонов характерны те же гены, которые имеются в плазмидах. Более того, нередко присутствие в составе плазмиды того или иного гена обусловлено наличием в последовательности плазмидной ДНК соответствующего транспозона. Он может быть устроен так же, как IS-элемент, но с дополнительным геном. Однако важно отметить, что часто два IS-элемента, оказавшиеся поблизости друг от друга, способны перемещаться вместе, одновременно перенося заключенный между ними сегмент ДНК. Таким образом, транспозон могут образовать два расположенных рядом IS-элемента. Транспозоны различной структуры показаны на конкретных примерах на рис. 5.7.

Рис. 5.6. IS-элемент Е. coli

Рис. 5.7. Некоторые бактериальные транспозоны

Транспозоны и IS-элементы ответственны за целый ряд генетических явлений у бактерий. Встраивание мобильного элемента в какой-либо ген может привести к его инактивации. Кроме того, некоторые IS-элементы и транспозоны вызывают генетическую нестабильность поблизости от места своей локализации: в окрестностях элемента заметно повышается частота делеций и инверсий, причем одна из границ перестройки всегда совпадает с одним из концов IS-элемента, автономного или в составе транспозона. Мобильные элементы способны также вызывать транслокации.

Механизмы перемещения мобильных элементов бактерий. Существует два типа транспозиций из одного генома в другой. В ходе транспозиции первого типа, называемой коинтеграционной, донорный геном, который несет IS-элемент или транспозон, сливается с реципиентной молекулой ДНК. Репликация за счет клеточного репликативного аппарата приводит к удвоению мобильного элемента. Образуется промежуточный коинтеграт с дупликацией мобильного элемента. Чтобы произошло разделение коннтеграта на исходные репликоны (один из которых приобрел бы новую копию мобильного элемента), необходимо действие продукта гена tnpR, называемого резолвазой (от англ, resolution — разрешение), которая разрезает коинтеграт на исходные репликаторы (рис. 5.8).

Рис. 5.8. Типы встраивания мобильного элемента в новый геном

Транспозиция второго типа называется простым встраиванием. Мобильный элемент перемещается в новый геномный локус, при этом никаких других перестроек, кроме дупликации сайта-мишени, не происходит. Этот вид транспозиции иногда называют консервативным (или нерепликативным). Для завершения процесса потребуется лишь ограниченный репаративный синтез ДНК.

Генетическая изменчивость бактерий. Мобильные элементы вызывают генетическую нестабильность поблизости от участка своей локализации, особенно в процессе репликативного механизма транспозиций. В зависимости от того, как внесены разрывы в ДНК- мишень, получится либо делеция, либо инверсия генетического материала между местом расположения транспозона и мишенью его перемещения. В связи с этим интересно отметить, что хромосомы родственных видов бактерий отличаются друг от друга многочисленными перестройками именно этого типа. По-видимому, мобильные элементы сыграли существенную роль в дивергенции и видообразовании бактерий. Встраивание IS-элементов поблизости от молчащего гена может приводить к его активации за счет транскрипции с промотора IS-элемента, т. е. изменяется регуляция бактериального гена. Очень важно, что мобильные элементы служат подвижными участками гомологии, гомологическая рекомбинация между которыми может приводить к дупликациям генов (рис. 5.9). Считается, что дупликация — один из основных путей эволюционного возникновения новых функций. Действительно, «лишняя» копия гена выходит из-под давления естественного отбора и получает возможность накапливать изменения. Чаще всего это приведет к утрате какой бы то ни было функции, но иногда может получиться ген с новыми функциями.

Рис. 5.9. Механизм образования дупликаций за счет гомологической рекомбинации по мобильным элементам (неравный кроссинговер)

Нельзя забывать и тот факт, что клетка может получить селективное преимущество за счет приобретения в составе транспозона гена, который сам по себе способен оказаться выгодным для бактерии в определенных условиях. Действительно, на транспозонах «путешествуют» гены устойчивости к различным бактериальным ядам, в том числе к тяжелым металлам и антибиотикам, гены дополнительных метаболических путей, позволяющие использовать необычный источник углерода, наконец, гены некоторых токсинов, делающие бактерии патогенными и позволяющие им тем самым существенно изменить образ жизни. Сказанное в равной степени относится и к плазмидам, поскольку большинство полезных для клетки-хозяина плазмидных генов находится в составе транспозонов.

Еще в конце 1980-х гг. после первых удачных попыток секвени- рования генома прокариот на примере Е. coli в их хромосоме были выявлены необычные участки ДНК. Они так же, как и прокариотические транспозоны, фланкированы инвертированными (палин- дромными) повторами, однако заключенные между ними короткие уникальные последовательности-спейсеры не только не кодируют какие-либо белки, но и вовсе кажутся бессмысленными. Позже эти последовательности, найденные и у других прокариот, были названы CRISPR (от англ. Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats — сгруппированные регулярно перемежающиеся короткие палиндромные повторы). Еще до понимания функций CRISPR они уже нашли свое практическое применение, на основе их уникальной структуры был разработан метод молекулярной идентификации штаммов бактерий — сполинготипирование. Позже, после накопления достаточного количества сведений о структуре геномов различных бактерий и вирусов, выяснили, что спейсеры идентичны фрагментам геномов бактериофагов, специфичных к соответствующему виду бактерии. Это явно неслучайное сходство указывало на одно очевидное предположение — CRISPR являются основой иммунитета бактерий, защищающего их от фагов, с которыми им когда-либо приходилось «встречаться» и благополучно пережить эту встречу. К настоящему времени известно три типа CRISPR-систем, отличающихся как структурно, так и функционально, однако общим у них является механизм иммунного ответа. Транскрипция всей кассеты CRISPR приводит к образованию пре-crPHK, который, благодаря инвертированным повторам, сворачивается в устойчивую многошпилечную вторичную структуру. Пре-crPHK процессируется и превращается в набор зрелых сгРНК — своеобразных «антител» нукле- ионовой природы. Наконец, к сгРНК присоединяется особый белок Cas9 (в системе CRISPR типа II) или несколько белков Cas — Cascade (в системах CRISPR типов I и III), в итоге формируется готовый комплекс узнавания чужеродной ДНК CRISPR-Cas. При попадании в клетку бактерии «знакомого» вируса после его раздевания спей- сер сгРНК взаимодействует с комплементарным протоспейсером вирусной ДНК, а нуклеазный домен самого комплекса CRISPR-Cas (в системе типа II) или активирующаяся им нуклеаза Cas3 (в системе типа I) наносят двуцепочечные разрывы ДНК-мишени, тем самым разрушая и инактивируя ее. В арсенале комплекса CRISPR-Cas III типа есть два фермента — ДНКаза и РНКаза, таким образом эта система способна противостоять как ДНК-, так и РНК-содержащим вирусам (Deltcheva et al., Nature, 2011). Важно, что бактериальный иммунитет не только располагает уже имеющимися в геноме бактерии CRISPR, но и способен накапливать информацию о новых, еще незнакомых, вирусах. Еще два белка Casl и Cas2 участвуют в вырезании из генома «незнакомого» вируса участков, которые впоследствии становятся спейсерами, постоянно пополняя «картотеку» прокариотического иммунитета (Datsenko et al., Nat Commun., 2012). Дальнейшие исследования показали, что системы CRISPR- Cas прекрасно работают и в эукариотических клетках, что открывает весьма значительные возможности для точнейшего редактирования генома человека и исправления мутаций, влекущих за собой серьезные генетические и геномные заболевания (такие как серповидно-клеточная анемия, мышечная дистрофия Дюшена, синдром Дауна и др. патологии), аутоиммунной природы, аллергии, онкологические заболевания и вирусные болезни, в том числе СПИД, гепатиты, герпес и пр. И не удивительно, что уже начиная с 2013 г., т. е. практически сразу после демонстрации таких возможностей, появилось сразу несколько статей в журнале Nature, публикующих весьма перспективные результаты редактирования генома человека (например, Cong et al., Nature, 2013; Prashant et al., Nature, 2013), а сам метод CRISPR-Cas был признан одним из величайших достижений генной инженерии спустя более чем 30 лет после изобретения ПЦР. В феврале 2016 года на Международном саммите по редактированию генов человека было дано официальное разрешение на генетическую модификацию человеческих эмбрионов с помощью CRISPR-Cas и родственных методов в терапевтических целях. Без ложной скромности следует добавить, что безусловный приоритет в первичной разработке вопроса о природе CRISPR и раскрытии механизмов функционирования этой системы принадлежит нашим соотечественникам, и в первую очередь Евгению Кунину, выпускнику МГУ, а ныне признанному всем мировым сообществом эксперту в области эволюционной и вычислительной биологии (биоинформатики), в настоящее время работающему в США.